1838 wurde in Neuenburg eine erste Akademie gegründet, die 1848 während der republikanischen Revolution wieder geschlossen wurde; eine zweite Akademie wurde 1866 eröffnet. Da diese keine Doktortitel verleihen durfte, war sie gegenüber den Universitäten der Schweiz in einer schwachen Position, weshalb sie 1909 in eine Universität ohne medizinische Fakultät umgewandelt wurde. Die vier bereits bestehenden Fakultäten, nämlich die geistes- und die naturwissenschaftliche, die theologische und die rechtswissenschaftliche Fakultät, blieben bestehen. 1910 wurde an die Letztgenannte eine Handelsabteilung angegliedert, woraus 1963 die rechts- und wirtschaftswissenschaftliche Fakultät entstand. 2003 wurde diese in zwei Fakultäten aufgeteilt.
Die Universität Neuenburg, die zunächst stärker von der Stadt als vom Kanton Neuenburg unterstützt wurde, musste lange um ihre Anerkennung kämpfen. Die Wirtschaftskrisen stellten ihren Fortbestand ernsthaft in Frage und im Grossen Rat wurde 1932 über ihre Schliessung debattiert. Nach dem Zweiten Weltkrieg kehrte das Vertrauen der Öffentlichkeit zurück und die Universität Neuenburg bekräftigte ihre Verankerung in der Gesellschaft. In der Folge wurden bedeutende Investitionen getätigt, so 1954 durch die Gründung eines botanischen und eines zoologischen Instituts. Nach der Entstehung des Schweizerischen Nationalfonds 1952 und der Einführung der Hochschulförderung des Bundes 1966 spielte die Universität Neuenburg, obschon sie immer noch eine bescheidene Institution war, weit über die Kantonsgrenzen hinaus eine wichtige Rolle, besonders im Jura. Die Krise der 1970er Jahre forderte ihr Opfer ab und zwang sie gleichzeitig, die Bedürfnisse der Industrie zu berücksichtigen. 1975 eröffnete die Universität Neuenburg das Institut für Mikrotechnik, das 2009 der ETH Lausanne angegliedert wurde. Von den 1980er Jahren an intensivierte die Universität Neuenburg ihre Zusammenarbeit mit anderen Institutionen, nämlich 1993 durch das Netzwerk Benefri mit Freiburg und Bern sowie ab 2003 im Rahmen des Triangle Azur mit Genf und Lausanne. Diese Strategie erhielt ab 1999 mit der Bologna-Reform und dem Hochschulförderungsgesetz zusätzlichen Auftrieb. 2006 entfielen von einem Budget von 127 Mio. Franken 34% auf Drittmittel (öffentliche und private Forschungsaufträge), 33% auf Kantons- und 21% auf Bundesbeiträge sowie 12% auf Beiträge anderer Kantone.
Die Universität Neuenburg, die zuerst im Gebäude der Akademie untergebracht war, sah sich bald mit Platzproblemen konfrontiert. Dies hatte zur Folge, dass die Seminare über die ganze Stadt verteilt und verschiedene Neubauten errichtet werden mussten, so 1986 der Sitz der geisteswissenschaftlichen Fakultät im Quartier Jeunes Rives. Der Lehrkörper umfasste im akademischen Jahr 1953/1954 81 Personen, 2010/2011 waren es 261 (davon 87 ordentliche und 20 ausserordentliche Professoren). 1943 trat Sophie Piccard als erste weibliche Lehrperson ein Ordinariat an. Die Zahl der Studierenden nahm von 200 im Jahr 1909 auf einige hundert in den 1950er Jahren zu. Danach stieg die Zahl kontinuierlich an: 1960/1961 wurden gegen 1000 Studierende gezählt, 2010/2011 über 4000. 1878 wurden an der Akademie erstmals Frauen zugelassen; seit 2001 macht ihr Anteil mehr als die Hälfte aller Studierenden aus, 2010/2011 waren es 59%.